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775反制措施（第1页）

尽管最近在晚期或转移性非小细胞肺癌的治疗方面取得了进展，但远处转移仍然是癌症相关死亡的主要原因和实现长期生存的障碍。远处转移是各种实体肿瘤发展的一个不祥的特征和最终结果，包括NSCLC。从肿瘤起源到播散的肿瘤细胞在远处器官的定植是一个多步骤但效率低下的过程。虽然我们对远处转移所涉及的细胞和分子机制有了很好的了解，但不同转移到原发肿瘤的遗传分化和系统发育关系仍然很大程度上是不确定的。

新的证据表明，肿瘤的发展可以被认为是一个不断进化的达尔文模型。转移也可以被看作是肿瘤细胞通过微观和或宏观进化转移从原发灶扩散到转移的进化过程。与经典的转移只有在肿瘤形成的后期才出现的观点不同，最近的研究表明这一过程可能发生在肿瘤形成的早期。为了系统地阐述这一过程，提出了两个一般的进展模型，即线性进展模型和平行进展模型。

这两种模式从两个维度加以区分：（1）原发灶出现转移的相对时间；（2）预期的遗传分化，特征是比较原发灶和匹配的转移灶之间突变的总和。尽管最近对原发肿瘤和转移灶的比较研究表明，不同类型的癌症可能同时存在线性和平行的转移进展，但目前尚不清楚癌症不同器官部位的转移是遵循相同还是不同的进展模式。此外，受癌症影响的同一转移器官的转移内和转移间的异质性仍未完全阐明。对这些问题的更好理解不仅将为转移过程的生物学提供新的见解，而且还将有可能揭示同时针对原发肿瘤和转移肿瘤的治疗策略的差异。

为了全面探讨肺腺癌最常见的两种转移方式--肝转移瘤（LiM）和脑转移瘤（BrM）的遗传差异和亲缘关系，我们对10例原发肿瘤（LIM-P）和肝转移瘤（LIM-M）、11例原发肿瘤（BRM-P）和脑转移瘤（BRM-M）的63例组织和血液标本进行了全外显子测序（WES）。为了保证肿瘤的自然进化状态，在任何系统治疗之前，都会将符合条件的组织和外周血液样本进行匹配。此外，我们还收集了另外16份手术样本和5例仅有BRMS的肺腺癌患者的配对外周血液，并对其进行了测序。我们的目标包括：（1）确定肺腺癌的LIM和BRM在其原发瘤的单核苷酸变异（SNV）和拷贝数变异（CNV）方面是否有不同的突变景观；（2）比较LIM和BRM的进化模式；（3）表征BRM的转移内和转移间的异质性。

最典型的突变驱动基因包括28例（66.7%）样本中的TP53（15例23例）和12例（28.6%）样本中的EGFR突变（6例23例）（图1A）。值得注意的是，TP53和EGFR突变在匹配的原发肿瘤和转移肿瘤之间高度一致。

为了研究肿瘤间的异质性，已识别的基因改变被分类为共享的（存在于原发和转移肿瘤中）或私有的（仅存在于原发和转移的肿瘤中）突变。23我们观察到LIM队列中肿瘤间的同质性明显更高，被鉴定为共享的基因突变的中位数为66.3%（范围为6.1%-97.1%）。这与BRM队列中发现的6.8%（范围为0.0%-30.5%）共享基因突变的中位数形成鲜明对比。

LIM-P和LIM-M之间的TMB相似（p>0.999）。

然后，我们利用皮尔逊相关分析计算突变相似度，以描述配对的原发肿瘤和转移肿瘤之间突变特征的一致性和差异性。如图1E和1F所示，我们观察到LIM组LIM-P和LIM-M之间的突变一致性较高，而BRM组BRM-P和BRM-M之间的突变一致性有限。统计分析表明，LIM组突变相似性的皮尔逊相关系数显著高于BRM组（p=0.019）。

我们用皮尔逊相关分析研究了配对的原发瘤和转移瘤之间CNV分布的不一致性。结果显示，LIM-P和LIM-M之间的CNV模式高度相似，10例中有9例（90.0%）的Pearson相关系数大于0.8。然而，配对的BRM-P和BRM-M之间的CNVS模式高度不一致，11例中只有4例（36.4%）的Pearson相关系数大于0.8。统计分析表明，LIM组的CNV相似性显著高于BRM组（p=0.035）。

总共有42条通路在这些样本中显著富集，与LIM-P相比，LIM-M具有独特的显著丰富的转移相关通路，如Notch信号和ECM-受体相互作用。Notch信号也在BRM-M中丰富，但在BRM-P中不丰富。并且，BRM-M，还有许多

独特的途径，如药物代谢、几种免疫相关途径、细胞凋亡和错配修复。为了了解BRM-P和BRM-M中的通路水平相似性是否也比LIM-P和LIM-M中的降低，我们进行了通路特征分析，并计算了样本组之间的通路水平相似性（参见材料和方法）。事实上，与它们相匹配的原发肿瘤相比，BRM-M有明显不同的途径富集，而LIM-M有更多相似的通路。（p=0.0011）。

2.配对原发和转移性肿瘤的系统发育关系

为了研究LIM和BRM的进化过程（例如，线性与平行发展模型4），我们研究了原发肿瘤和它们匹配的转移瘤之间的系统发育关系。我们推断了基因组改变的序列，然后使用两种独立的算法重建了每种情况下的系统发育树。我们在图3A中列出了每组的三个有代表性的案例。

3.配对BRM的转移内和转移间同质性

由于BRM在配对的原发灶和转移灶之间表现出明显低于LIM组的突变和拷贝数变异相似性，因此我们随后研究了BRM的转移内和转移间的异质性。我们采用了如前所述的方法研究BRM的转移内（单个BRM的多个区域）和转移间（来自同一患者的多个BRM）的异质性，24例，并收集了另外5例肺腺癌患者的BRM标本。如图4所示，单个BRM病灶被分成来自患者BrM91、BrM93和BrM94的三到四个部分，用于转移内分析。为了进行转移间异质性分析，分别从患者BrM95和BrM96收集了3个和2个BRM病灶。这些样本中最典型的突变驱动基因是EGFR和TP53。同样，转移内和转移间的样本中EGFR突变是完全一致的。

同一患者的所有样本的突变模式和特征几乎一致（图4A）。此外，我们还重建了每个病例的系统发育树。如图4B所示，所有病例的不同转移样本都可以追溯到单系关系，这表明多个BRMS的共同起源是占优势的。

?讨论?

尽管最近在各种癌症的治疗方面取得了进展，但科学发现尚未有效地转化为预防和治疗转移，这仍然是治疗失败和令人沮丧的长期生存的主要挑战。越来越多的证据表明，转移在一定程度上是原发肿瘤进化的产物。转移能力强的克隆可能出现在原发肿瘤进展的早期和晚期。更好地了解转移过程及其进展模式被认为具有重要的临床意义；因此，这些发现最终可能导致预防和控制远处转移的新策略。此外，阐明不同转移部位的独特突变格局和进化模式可能有助于为临床上这一未得到满足的需求制定精确的策略。

为了达到这一目标，我们对21例患有LIM或BRM的肺腺癌进行了WES，以研究它们的突变格局和进化模式。此外，我们还对另外5个单发BRMS进行了多区域WES检查，以探讨转移内或转移间的异质性。我们的研究发现，与原发肿瘤相比，BRM-M呈现出比LIM-M更不同的突变格局。BRM和LIM的肺腺癌发生发展轨迹完全不同。BRM更有可能有一个并行进化模型，而LIM更有可能有一个线性模型。最后，我们发现在BRM-M中转移间和转移内的同质性很普遍。

我们首先在SNV水平上研究了LIM和BRM的突变情况。虽然原发肿瘤与匹配的LIM-M或BRM-M在突变模式和突变特征上没有太大差异，但我们确实注意到BRM-M具有更高比例的特异体细胞突变，这表明BRM-M与LIM-M相比在遗传学上与其原发肿瘤的差异更大。由于SNV的局限性，我们进一步观察了CNV的模式。然而LIM-M与原发肿瘤的高度一致性被注意到，而BRM组没有观察到这样的发现。此外，BRM-M的CNV水平明显高于LIM-M。鉴于CNV是染色体不稳定（CIN）的一个重要指标，而且以前的文献表明CIN与转移有关，CIN在BRM的形成和发展中的重要作用值得进一步研究。最近，Shih等人报道了MYC、YAP1或MMP13的过表达可能会增加BRM的发生率，这表明对足够数量的转移肿瘤进行基因组测序可以找到以前未知的转移驱动因素。总而言之，这些发现使得我们有理由认为，向不同器官发起转移的克隆可能遵循不同的进化路径。这确实让人想起兰伯特等人。陈述转移能力不是原发肿瘤进展的偶然结果，而是在原发肿瘤进化过程中选择的性状，以及经典的“种子和土壤”假说。

早期对不同癌症的研究，包括乳腺癌和结直肠癌，显示出原发肿瘤和转移肿瘤之间的高度一致性，表明了线性进展模型。这些结果达成了一种观点

，即使用原发肿瘤的测序数据来指导转移病变的治疗。然而，最近的一项研究对这一范式提出了挑战，该研究发现有转移能力的克隆在原发前列腺癌和转移癌中的早期扩散和平行进展。类似地，赵等人报告了对原发肿瘤和转移瘤（包括13例肺癌），并发现有11例遵循平行进展。类似地，赵等人9报告了40对原发肿瘤和转移瘤（包括13例肺癌），并发现11例遵循平行进展。此外，Hosseini等人发现，超过80%的转移来自早期播散的乳腺癌细胞，而那些早期播散的癌细胞比后期播散的癌细胞更具转移能力。因此，这些结果表明，在癌症演变过程中，平行和线性进展模式并存。在这项研究中，我们发现线性进展模型在LIM中的优势，而平行进展模型在BRM中的优势，提出了结合转移灶，特别是BRM的遗传信息来指导这些患者更好的量身定制治疗的必要性。

最后，我们对BRM的转移内和转移间异质性进行了初步分析。尽管样本量很小，但我们观察到了转移内和转移间的同质性，正如之前报道的那样。在同一患者的不同BRM病变中，发现驱动基因改变、突变模式和突变特征几乎是一致的。同时，系统发育分析表明，所有肿瘤标本，无论来自相同或不同的转移部位，都可以追溯到单系关系，这表明多个BRMS存在共同起源。此外，我们还观察了单个转移灶和不同BRM病灶内不同的分歧时间点。因此，我们推测BRM可能真的存在微小的微进化转变，目前尚不清楚其生物学功能。综上所述，我们的研究进一步强调了BRM进化的复杂性和独特性。

综上所述，我们的研究揭示了同一原发肿瘤转移到不同器官部位可能有不同的突变景观和进化轨迹。这些发现将为转移过程的生物学提供新的见解，并为开发预防和靶向远处转移的新方法提供有用的信息。

这项研究的发现可能有几个临床意义。首先，我们观察到LIM和BRM队列中驱动基因（如TP53和EGFR）功能突变的同质性。这与最近对未经治疗的癌症的遗传异质性的分析一致，该分析还发现，来自同一原发肿瘤的转移瘤中100%的驱动程序突变是同质的，这表明成对的原发和转移病变之间功能驱动程序基因突变的高度同质性。其次，对于LIM患者，LIM-M的突变情况与其匹配的原发肿瘤高度相似，这表明在描绘突变特征时，原发肿瘤对LIM-M的可替换性。然而，由于BRM-M更有可能有一个平行的进化模式，我们应该意识到，在给定的临床环境下，通过对原发肿瘤进行一次活检确定的可操作突变可能不代表BRM-M的突变。第三，空间上分离的脑转移灶在基因上是同质的，BRM-M的分支突变比例明显更高，这表明脑转移瘤谱系的额外进化。针对脑转移瘤的靶向性改变代表着新的靶向治疗策略克服治疗耐药性的重要机会，并将影响总体生存。第四，肺腺癌LIM和BRM之间存在着不同的突变格局和进化模式，这意味着需要采取精确的策略来治理这两个不同的转移病灶，同时也提出了一个问题，即研究其他常见转移病灶（如骨和肾上腺转移）的进化模式。